Les 16e et 17e siècles, situés entre deux grandes périodes d'expansion commerciale, furent moins opulents bien que le port continue de prospérer. Le quartier des Chartrons voit le jour. A cette période, Bordeaux devient un important foyer culturel, et la création du collège de Guyenne en 1533, permet la formation de plusieurs générations d'humanistes, dont Montaigne. C'est également au 16e siècle que les institutions se mettent en place. Le gouverneur représente le Roi en Guyenne. Il nomme les membres du Parlement et le maire. Les jurats, quant à eux, gardent un pouvoir de police et les privilèges urbains. Mais face aux pressions fiscales, les marchands s'insurgent au mois d'août 1548. La ville est alors privée de ses libertés communales pendant un an. Ce n'est que douze ans plus tard, que le Roi, Charles IX, rendra à l'Hôtel de ville sa Grosse Cloche confisquée et les clés de la ville. L'autorité royale est tout de même renforcée en matière fiscale et religieuse avec l'Edit de Nantes sous le règne de Henri IV. Les libertés municipales sont réduites d'avantage encore par son fils Louis XIII.